Phospho-AMPK Substrate Motif [LXRXX(pS/pT) MultiMab™ 兔单克隆抗体混合物 |细胞信号技术

来自 : 发布时间：2024-12-26

class=\"container-fluid\">Supporting DataRelated ProductsProduct UsageProtocolsBackgroundPathwaysCitations & ReviewsOn Page MenuProductsPrimary AntibodiesPhospho-AMPK Substrate Motif [LXRXX(pS/pT) MultiMab™ Rabbit mAb mixRecombinant：卓越的批次间一致性、连续供应和无动物制造...因此，重组抗体越来越多地用于科学研究，尤其是作为解决持续的可重复性危机的一种手段。什么是重组抗体？

传统的多克隆抗体和单克隆抗体是正常B细胞​​发育的产物ent和基因重组。它们是通过用抗原对动物进行免疫以引发免疫反应而产生的。多克隆抗体由许多不同的 B 细胞克隆分泌并识别多个抗原表位，而单克隆抗体源自单个 B 细胞克隆并且仅针对一个表位。

重组抗体是单克隆抗体，但它们的产生涉及体外遗传操作。将抗体基因克隆到表达载体中后，将其转染到合适的宿主细胞系中进行抗体表达。哺乳动物细胞系最常用于重组抗体生产，尽管细菌、酵母或昆虫来源的细胞系也适用。

出色的批次间一致性

因为重组抗体生产涉及对抗体光进行测序和重型链条，这是一个高度可控且可靠的过程。相比之下，用于生产单克隆抗体的基于杂交瘤的系统是受遗传漂变和不稳定性，增加批次间变异或抗体表达损失的可能性。重组抗体在批次之间高度一致，从而确保可重复的实验结果。

可扩展性

用于生产抗体的体外方法适合大规模生产，这意味着抗体可用性不太可能成为限制因素。此外，由于重组抗体序列已知，供应的连续性得到保证；在抗体将用于支持大型、长期研究的情况下，这可能是一个特别关键的因素。

无动物制造

与抗体生产的传统方法不同，重组方法无需使用动物。当多克隆抗体直接从免疫宿主的血清中纯化，单克隆抗体从杂交瘤来源的组织培养上清液或腹水中纯化时，重组抗体则从组织中纯化使用转染宿主细胞系的培养上清液。无论抗体是多克隆抗体、单克隆抗体还是重组抗体，在实验使用之前，都必须始终在预期应用中对其进行适当验证。在 CST，我们遵守 Hallmarks of Antibody Validation™，这是确定抗体在任何给定测定中的特异性、灵敏度和功能的六种互补策略。通过针对每种抗体产品仔细定制这些策略，我们保证 CST 抗体将按预期发挥作用，帮助您获得值得信赖的结果。

Phospho-AMPK Substrate Motif [LXRXX(pS/pT) MultiMab™ Rabbit mAb mix #5759Reviews ()Citations (49)Filter:WBIP使用 Phospho-AMPK Substrate 对来自不同小鼠组织的提取物进行蛋白质印迹分析基序 [LXRXX(pS/pT) MultiMab™ Rabbit mAb mixShow LessShow More 对未经处理或经苯乙双胍（5 mM，1 小时）处理的 H1650 细胞提取物进行蛋白质印迹分析, 使用

Phospho-AMPK Substrate Motif [LXRXX(pS/pT) MultiMab™ Rabbit mAb mix。使用 Odyssey® 红外成像系统 (LI-COR® Biosciences) 对蛋白质印迹进行成像。显示更少显示更多 使用 Phospho-AMPK 底物基序 [LXRXX(p) 对 H1650 细胞提取物进行免疫沉淀小号/pT) MultiMab™ 兔单克隆抗体混合物。泳道 1 显示 10% 的输入。使用 sa 进行蛋白质印迹分析me antibody.Show LessShow More 图片库详细了解我们如何获取图像 × Phospho-AMPK Substrate Motif [LXRXX(pS/pT) MultiMab™ Rabbit mAb mix 5759 Toggle BetweenDark and Light ModesFilter:WBIP 使用 Phospho-AMPK Substrate Motif [LXRXX(pS/pT) MultiMab™ Rabbit mAb mix 对未经处理或处理的 H1650 细胞提取物进行蛋白质印迹分析与苯乙双胍（5 mM，1 小时），使用

Phospho-AMPK Substrate Motif [LXRXX(pS/pT) MultiMab™ Rabbit mAb mix。 Western blot 是 ima使用 Odyssey® 红外成像系统 (LI-COR® Biosciences) 进行分析。 使用 Phospho-AMPK Substrate Motif [LXRXX(pS/pT) MultiMab™ Rabbit mAb mix. 对 H1650 细胞提取物进行免疫沉淀。泳道 1 显示 10% 的输入。使用相同的抗体进行蛋白质印迹分析。购买#5759Cat。 ＃sizeQty.price5759S100µl $ 364

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Antibody GuaranteeFAQTech Support-- 数据表 --Without ImagesWith ImagesSDS: Choose Your Region美国-英语欧洲-中国欧洲e-DutchEurope-EnglishEurope-FrenchEurope-GermanEurope-ItalianEurope-KoreanEurope-PortugueseEurope-SpanishEurope-SwedishSupporting DataRelated ProductsProduct UsageProtocolsBackgroundPathwaysCitations & ReviewsSupporting DataREACTIVITYAllSENSITIVITYEndogenousMW (kDa)Source/IsotypeRabbitApplication Key:WB-Western BlotIP-ImmunoprecipitationIHC-免疫组织化学ChIP-色谱法在免疫沉淀中C&R-CUT&RUNC&T-CUT&TagDB-Dot BloteCLIP-eCLIPIF-免疫荧光F-流式细胞术物种交叉反应键：H-HumanM-MouseR-RatHm-HamsterMk-MonkeyVir-VirusMi-MinkC-ChickenDm-D。 melanogasterX-XenopusZ-ZebrafishB-BovineDg-DogPg-PigSc-S。酿酒酵母 Ce-C. elegansHr-HorseGP-Guinea PigRab-RabbitAll-All Species Expected相关产品

产品信息

产品使用信息ApplicationDilutionWestern Blotting1:1000Immunoprecipitation1:100Peptide ELISA (DELFIA)1:1000StorageSupplied in 10 mM sodium HEPES (pH 7.5) ), 150 mM NaCl, 100 µg/ml BSA, 50% 甘油和 l小于 0.02% 的叠氮化钠。储存于 –20°C。不要等分抗体。方案选择您的方案Western BlottingImmunoprecipitationPRINT

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Western Blotting Protocol

对于蛋白质印迹，将膜与稀释的一抗在 5% w/v BSA、1X 中孵育TBS，0.1% Tween® 20，4°C 轻轻摇动，过夜。

注意：有关推荐的抗体稀释度，请参阅一抗产品网页。

A.溶液和试剂

从样品制备到检测，Western Blot 所需的试剂现在都在一个方便的试剂盒中：#12957 Western Blotting Application Solutions Kit

注意：用反渗透去离子（ ... (#12498) 要制备 1 L 1X TBS：将 100 ml 10X 添加到 900 ml dH2O，混合 1X SDS 样品缓冲液：蓝色加载包 (#7722) 或红色加载包(#7723) 通过将 1/10 体积的 30X DTT 添加到 1 体积的 3X SDS 加载缓冲液中来制备新鲜的 3X 还原加载缓冲液。用 dH2O 稀释至 1X。10X Tris-甘氨酸 SDS 电泳缓冲液：(#4050) 要制备 1 L 1X 电泳缓冲液：将 100 ml 10X 电泳缓冲液添加到 900 ml dH2O 中，混合。10X Tris-甘氨酸转移缓冲液：(#12539)要制备 1 L 1X 转移缓冲液：将 100 ml 10X 转移缓冲液添加到 200 ml 甲醇 + 700 ml dH2O 中，混合。10X Tris Buffered Saline with Tween® 20 (TBST)：(#9997) 要制备 1 L 1X TBST：添加 100 ml 10X TBST 至 900 ml dH2O，混合。脱脂奶粉：(#9999)。封闭缓冲液：1X TBST 含 5% w/v 脱脂奶粉；对于 150 ml，将 7.5 g 脱脂奶粉添加到 150 ml 1X TBST 中并充分混合。洗涤缓冲液：(#9997) 1X TBST。牛血清白蛋白 (BSA)：(#9998)。一抗稀释缓冲液：1X TBST 与 5 ％牛血清白蛋白；对于 20 ml，将 1.0 g BSA 添加到 20 ml 1X TBST 中并充分混合。生物素化蛋白 Ladder 检测包：(#7727)。蓝色预染蛋白标记物，宽范围 (11-250 kDa)：(#59329)。印迹膜和d 论文：(#12369) 该方案已针对硝酸纤维素膜进行了优化。通常建议孔径为 0.2 µm。与 HRP 偶联的二抗：抗兔 IgG，HRP 连接抗体 (#7074)。检测试剂：SignalFire™ ECL 试剂 (#6883)。B. Protein BlottingA general protocol for sample preparation. 通过在所需时间内添加含有调节剂的新鲜培养基来处理细胞。用 1X PBS 清洗细胞；吸出。通过添加 1X SDS 样品缓冲液（6 孔板每孔 100 µl 或 10 cm 直径板每孔 500 µl）来裂解细胞。立即从板上刮下细胞并将提取物转移到微量离心管中。置于冰上。超声处理 10-15 秒以完成细胞裂解和剪切 DNA（以降低样品粘度）。将 20 µl 样品加热至 95-100°C 5 分钟；在冰上冷却。微量离心 5 分钟。

将 20 µl 上样到 SDS-PAGE 凝胶（10 厘米 x 10 厘米）上。

注意：上样预染分子量标记（#59329，10 µl/ lane) 来验证 electrotran推荐使用 sfer 和生物素化蛋白质梯（#7727，10 µl/泳道）来确定分子量。

电转移到硝酸纤维素膜（#12369）。C。膜封闭和抗体孵育

注意：体积适用于 10 cm x 10 cm (100 cm2) 的膜；对于不同尺寸的膜，相应地调整体积。

I.膜封闭（可选） 转移后，在室温下用 25 ml TBS 洗涤硝酸纤维素膜 5 分钟。将膜在 25 ml 封闭缓冲液中室温孵育 1 小时。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。二。一抗孵育将膜和一抗（按照产品网页中推荐的适当稀释度和稀释剂）在 10 ml 一抗稀释缓冲液中孵育，在 4°C 下轻轻搅拌过夜。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。用 Anti-rabbit IgG、HRP-linked Antibody（#7074，1:2000）和抗生物素、HRP-linked Antibody（#7075，1:1000–1:30）孵育膜00) 在 10 ml 封闭缓冲液中检测生物素化蛋白标记物，室温下轻轻搅拌 1 小时。用 15 ml TBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。继续检测（D 部分）。蛋白质检测使用说明：在 TBST 中将膜结合的 HRP（抗体偶联物）洗涤 3 次，每次 5 分钟。通过稀释一份 2X 试剂 A 和一份 2X 试剂 B（例如，用于 10毫升，加入 5 毫升试剂 A 和 5 毫升试剂 B）。充分混合。将底物与膜一起孵育 1 分钟，去除多余的溶液（膜保持湿润），用塑料包裹并暴露在 X 射线胶片上。

* 避免反复接触皮肤。

2005 年 6 月发布

2020 年 6 月修订

方案 ID：10

天然蛋白质的免疫沉淀

本方案是旨在对天然蛋白质进行免疫沉淀，以便通过蛋白质免疫印迹或利用蛋白质 A 磁分离进行激酶活性分析。

A.解决方案s 和试剂

注意：使用反渗透去离子 (RODI) 或同等级别的水制备溶液。

20X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：(#9808) 要制备 1 L 1X PBS，添加 50 ml 20X PBS 加入 950 ml dH2O，混合。

10X 细胞裂解缓冲液：(#9803) 要制备 10 ml 1X 细胞裂解缓冲液，将 1 ml 细胞裂解缓冲液加入 9 ml dH2O，混合。

注意：在使用前立即添加 1 mM PMSF (#8553)。

3X SDS 样品缓冲液：蓝色加载包 (#7722) 或红色加载包 (#7723) 通过添加 1/10 制备新鲜的 3X 还原加载缓冲液体积 30X DTT 至 1 体积的 3X SDS 加载缓冲液。蛋白 A 磁珠：(#73778)。磁性分离架：(#7017) 或 (#14654)。10X 激酶缓冲液（用于激酶测定）：(#9802)准备 1 ml 1X 激酶缓冲液，将 100 µl 10X 激酶缓冲液添加到 900 µl dH2O 中，混合 ATP (10 mM)（用于激酶测定）：(#9804) 要制备 0.5 ml ATP (200 µM)，添加 10 µl ATP (10 mM) 至 490 µl 1X 激酶缓冲液。B.准备细胞裂解物吸出培养基。通过添加新鲜培养基处理细胞含有所需时间的调节剂。要在非变性条件下收获细胞，去除培养基并用冰冷的 1X PBS 冲洗细胞一次。去除 PBS 并向每个板 (10 cm) 添加 0.5 ml 冰冷的 1X 细胞裂解缓冲液并在冰上孵育5 分钟。从板上刮下细胞并转移到微量离心管中。保持在冰上。在冰上超声处理 3 次，每次 5 秒。在 4°C 下以 14,000 x g 微量离心 10 分钟，并将上清液转移到新管中。上清液是细胞裂解物。如有必要，可将裂解物储存在 -80°C.C 下。免疫沉淀细胞裂解物预澄清（可选）

强烈推荐细胞裂解物预澄清步骤，以减少非特异性蛋白质与 Protein A 磁珠的结合。预澄清足够的裂解物用于测试样品和同种型对照。

短暂涡旋储备管以重悬磁珠。

重要：使用前预洗 #73778 磁珠：

转移 20微升珠浆到干净的管中。将管子放入 ma磁力分离架 10-15 秒。

溶液澄清后小心取出缓冲液。向磁珠沉淀中加入 500 μl 1X 细胞裂解缓冲液，短暂涡旋以清洗磁珠。将管放回磁力分离架。解决方案澄清后取出缓冲液。再次重复洗涤步骤。

将 200 μl 细胞裂解物添加到 20 μl 预洗磁珠中。

重要提示：最佳裂解物浓度将取决于目标蛋白质的表达水平。建议起始浓度在 250 μg/ml-1.0 mg/ml 之间。

在室温下旋转孵育 20 分钟。使用磁力分离架将珠子与裂解物分离，将预澄清的裂解物转移到清洁试管，并丢弃磁珠沉淀。继续进行免疫沉淀部分。免疫沉淀

重要提示：强烈建议使用适当的同种型对照，以显示一抗免疫沉淀中的特异性结合。使用正常兔 IgG #2729 用于兔多克隆一抗，兔 (DA1E) mAb IgG XP® 同型对照 #3900 用于兔单克隆一抗，小鼠 (G3A1) mAb IgG1 同型对照 #5415 用于小鼠单克隆 IgG1 一抗，小鼠 (E5Y6Q) mAb IgG2a 同型对照#61656 用于小鼠单克隆 IgG2a 一抗，Mouse (E7Q5L) mAb IgG2b Isotype Control #53484 用于小鼠单克隆 IgG2b 一抗，Mouse (E1D5H) mAb IgG3 Isotype Control #37988 用于小鼠单克隆 IgG3 一抗。同种型对照应浓度匹配并与一抗样品一起运行。

将一抗（按照产品数据表中推荐的适当稀释度）添加到 200 µl 细胞裂解物中。在 4°C 下旋转孵育过夜。形成免疫复合物。预洗磁珠（参见细胞裂解物预清除部分，步骤 1 和 2）。将裂解物和抗体（免疫复合物）溶液转移到含有预洗磁珠沉淀的试管中。Incuba在室温下旋转 20 分钟。使用磁力分离架沉淀珠子。用 500 μl 1X 细胞裂解缓冲液洗涤沉淀物五次。在两次洗涤之间保持在冰上。继续通过蛋白质免疫印迹或激酶活性进行分析（D 部分）。样品分析

继续执行以下一组特定步骤。

通过蛋白质免疫印迹分析用 20-40 µl 3X SDS 样品缓冲液重悬沉淀物，短暂涡旋混合，然后短暂微量离心以沉淀样品。将样品加热至 95-100°C，持续 5 分钟。使用磁力分离架沉淀珠粒。将上清液转移到新管中。上清液即为样品。通过蛋白质印迹法分析样品（参见蛋白质免疫印迹实验步骤）。

注意：为尽量减少变性 IgG 重链 (~50 kDa) 引起的掩蔽，我们建议使用小鼠抗兔 IgG（轻链Specific) (D4W3E) mAb (#45262)​​ 或小鼠抗兔 IgG（构象特异性）(L27A9) mAb (#3678)（或 HRP 偶联物 #5127）。为了尽量减少马由变性 IgG 轻链 (~25 kDa) 引起的皮肤脱落，我们建议使用 Mouse Anti-Rabbit IgG (Conformation Specific) (L27A9) mAb (#3678)（或 HRP conjugate #5127）。

通过 Kinase AssayWash 进行分析用 500 µl 1X 激酶缓冲液沉淀两次。保持在冰上。将沉淀悬浮在 40 µl 1X 激酶缓冲液中，辅以 200 µM ATP 和适当的底物。在 30°C 下孵育 30 分钟。用 20 µl 3X SDS 样品缓冲液终止反应。涡旋，然后微量离心 30 秒。将含有磷酸化底物的上清液转移到另一管中。将样品加热至 95-100°C 2-5 分钟，然后以 14,000 x g 微量离心 1 分钟。加载样品 (15-30 µl)在 SDS-PAGE 凝胶上。

2008 年 12 月发布

2021 年 4 月修订

方案 ID：410

ELISA PeptideA。溶液和试剂碳酸盐缓冲液：15 mM Na2CO3、35 mM NaHCO3、0.2 g/L NaN3 (pH 9.6)。在碳酸盐缓冲液中使用 1 μM 合成肽。10X 磷酸盐缓冲盐水 (PBS)：要制备 1 L，添加 80 g 氯化钠氯化钾 (NaCl)、2 g 氯化钾 (KCl)、14.4 g 磷酸钠、二元 (Na2HPO4) 和 2.4 g 磷酸钾、二元 (KH2PO4) 至 1 L dH2O。将 pH 值调整至 7.4。洗涤缓冲液：1X PBS，含 0.05% Tween-20 (PBST) 封闭缓冲液：10 mg/ml 牛血清白蛋白 (BSA) 的 PBST 抗体稀释缓冲液：3% BSA 的 PBSTDELFIA® Europium-labeled Anti-mouse IgG用于小鼠一抗或抗兔 IgG (PerkinElmer Life Sciences #AD0124) 用于兔一抗。DELFIA® Enhancement Solution (PerkinElmer Life Sciences #1244-105)

（DELFIA® 是 PerkinElmer, Inc. 的注册商标）

B. Protocol 通过在 4°C 下孵育过夜或在 37°C 下孵育 2 至 6 小时，在 96 孔微量滴定板的孔中涂上 100 μl 1 μM 合成肽的碳酸盐缓冲液。如果肽不结合或不吸收，请尝试使用 pH 4–8 范围内的其他缓冲液。用洗涤缓冲液以 200 μl/孔的量清洗板 3 次。用 200 μl/孔的封闭缓冲液在 37°C 下封闭板 1 小时。用wash洗板3次缓冲。 （如果需要，可将干板在 4°C 下放置 1-2 个月。）用抗体稀释缓冲液制备一抗的适当稀释液。向孔中加入 100 μl 并在 37°C 下孵育 1 小时。用洗涤缓冲液洗涤 3 次。加入 67 ng/孔 DELFIA Europium 标记的抗小鼠 IgG 或抗兔 IgG，用 100 μl/孔抗体稀释缓冲液稀释.在温和的振荡器上室温孵育 30 分钟。用洗涤缓冲液洗涤 3 次。加入 100 μl 增强溶液并在室温孵育 5 分钟。使用适当的时间分辨读板器在 615 nm 读取板。

2005 年 6 月发布

2007 年 9 月修订

方案 ID：34特异性/灵敏度Phospho-AMPK Substrate Motif [LXRXX(pS/pT) MultiMab™ Rabbit mAb mix 优先识别带有 LXRXXpS/pT 基序的内源性蛋白质和肽。该抗体还与仅含有 RXXpS/pT 基序的蛋白质和肽发生交叉反应。物种反应性：

All Species Expected

Source / Purification

MultiMab™ 兔单克隆混合抗体是通过将单个兔单克隆克隆按批准的应用程序的优化比例组合而制备的。混合物中的每种抗体都是根据基序识别和在多种检测中的表现精心挑选的。每种混合物都经过精心设计，以尽可能广泛地覆盖正在研究的修饰，同时确保对修饰或基序的高度特异性。

背景

AMP 活化蛋白激酶 (AMPK) 从酵母到植物和动物，并在调节能量稳态中发挥关键作用 (1)。 AMPK 是一种异源三聚体复合物，由催化性 α 亚基和调节性 β 和 γ 亚基组成，每个亚基由两个或三个不同的基因编码（α1, 2；β1, 2；γ1, 2, 3）(2)。由于细胞和环境压力，如热休克、缺氧和缺血，AMP/ATP 比率升高会激活该激酶 (1)。肿瘤苏抑制因子 LKB1 与辅助蛋白 STRAD 和 MO25 联合，磷酸化激活环中 Thr172 位点的 AMPKα，并且这种磷酸化是 AMPK 激活所必需的 (3-5)。 AMPKα 也在 Thr258 和 Ser485（对于 α1；Ser491 对于 α2）处被磷酸化。上游激酶和这些磷酸化事件的生物学意义尚未阐明 (6)。 β1 亚基通过豆蔻酰化和多位点磷酸化进行翻译后修饰，包括 Ser24/25、Ser96、Ser101、Ser108 和 Ser182 (6,7)。 β1 亚基 Ser108 的磷酸化似乎是 AMPK 激活所必需的，而 Ser24/25 和 Ser182 的磷酸化会影响 AMPK 定位 (7)。已经确定了 AMPKγ 亚基中的几个突变，其中大部分位于假定的 AMP/ATP 结合位点（CBS 或 Bateman 域）。这些位点的突变会导致 AMPK 活性降低，并导致心脏或骨骼肌中的糖原积累 (1,2)。收集证据指出 AMPK 不仅调节脂肪酸和糖原的代谢，还通过 EF2 和 TSC2/mTOR 通路调节蛋白质合成和细胞生长，以及通过 eNOS/nNOS (1) 调节血流。~AMPK 磷酸化共有基序 (L /M)XRXX(S/T)XXXL (8)。识别 LXRXX(S/T) 基序的抗体在鉴定 AMPK 底物方面非常有用。

Hardie, D.G. (2004) J Cell Sci 117, 5479-87.Carling, D. (2004) Trends Biochem Sci 29, 18-24.Hawley, S.A. 等。 (1996) J Biol Chem 271, 27879-87.Lizcano, J.M. 等。 (2004) EMBO J 23, 833-43.Shaw, R.J.等。 (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101, 3329-35.Woods, A. 等。 (2003) J Biol Chem 278, 28434-42.Warden, S.M.等。 (2001) Biochem J 354, 275-83.Gwinn, D.M.等。 (2008) Mol Cell 30, 214-26.Limited Uses

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